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2024年11月22日，大阪大學Masahiro Yamamoto教授團隊，在國際知名期刊Science（IF=56.9）在線發表題為：Platelet factor 4–induced TH1-Treg polarization suppresses antitumor immunity的論文。研究了腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）和血小板因子4（PF4）在腫瘤微環境（TME）中的作用，以及它們對T輔助1（TH1）極化的調節性T細胞（TH1-Treg細胞）和抗腫瘤免疫的影響。腫瘤微環境（TME）中存在多種免疫抑制細胞，其中調節性T細胞（Treg細胞）是一類重要的免疫細胞，在維持免疫穩態和抑制自身免疫中發揮關鍵作用。然而，在TME中，Treg細胞會向TH1-Treg細胞極化，這種極化狀態會抑制抗腫瘤免疫。研究發現，腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）會分泌PF4，該因子可以促進Treg細胞向TH1-Treg細胞極化。在腫瘤小鼠模型中，通過基因敲除或單克隆抗體中和PF4，可以減少TME中的TH1-Treg細胞數量，增強抗腫瘤免疫，并抑制腫瘤生長。此外，研究還發現，PF4的中和抗體可以抑制TH1-Treg細胞的極化，從而抑制腫瘤生長。

介紹：

在腫瘤塊中，不僅存在腫瘤細胞，還存在各種非腫瘤細胞（如免疫細胞、成纖維細胞和血管細胞），形成所謂的腫瘤微環境 （TME）。TME 中的一些免疫細胞，如細胞毒性 CD8+ T 細胞和自然殺傷細胞，發揮抗腫瘤作用，而其他免疫細胞則表現出促腫瘤功能。調節性 T 細胞（Treg 細胞）是輔助性 CD4+ T 細胞的一個亞群，在維持健康個體的免疫穩態和抑制自身免疫方面發揮著重要作用。在 Treg 細胞中，稱為輔助性 T 細胞 1 （TH1） 型 Treg （TH1-Treg 細胞）的亞群在腫瘤塊內高度積累并抑制抗腫瘤免疫。靶向 TH1-Treg 細胞進行去除可能是一種很有前途的癌癥免疫治療策略，因為它被認為比去除所有 Treg 細胞更安全，后者可能導致自身免疫。然而，人們對驅動 TH1-Treg 細胞在 TME 中高度積累的分子機制知之甚少。

原理：

巨噬細胞是存在于各種組織中（包括 TME）的先天免疫細胞，它們可以分化為腫瘤相關巨噬細胞 （TAM），這是一種在促進腫瘤生長和調節免疫反應中起關鍵作用的特殊亞群。由于先前的研究表明，單克隆抗體 （mAb） 介導的巨噬細胞耗竭會減少 TME 中的 Treg 細胞，因此我們質疑 TAMs 是否與 TME 中 TH1-Treg 細胞的存在增加有關。為了探索這種潛在的因果關系，我們開發了一種轉基因小鼠模型，其中 TAM 可以通過使用稱為 VeDTR 的交叉遺傳細胞靶向系統進行特異性標記和有條件地耗盡。我們假設使用這些小鼠將使我們能夠分析 TAM 耗竭對 TME 中 TH1-Treg 細胞群的影響，并揭示 TAMs 和 Treg 細胞之間的細胞通訊。

結果：

與其他組織駐留巨噬細胞相比，TAM 以高水平和排他性水平表達精氨酸酶 1 （Arg1）。當我們在 VeDTR 系統中選擇 Cx3cr1 和 Arg1 基因時， Arg1⁺巨噬細胞在荷瘤小鼠中被特異性靶向。使用這些小鼠，我們發現 Arg1⁺巨噬細胞構成了 TAM 的主要子集，并且在其他器官中未檢測到。在耗盡Arg1⁺TAM后，我們觀察到 TME 中腫瘤生長和 TH1-Treg 細胞比率降低。然后，我們檢查了Arg1⁺TAM是否誘導 Treg 細胞極化為 TH1-Treg 細胞。與 Arg1⁺TAM共培養誘導 TH1-Treg 細胞極化，即使沒有直接的物理相互作用。當我們使用單細胞和批量 RNA 測序分析源自誘導 TH1-Treg 細胞極化的Arg1⁺TAM的體液因子時，我們確定了一種稱為血小板因子 4 （PF4） 的趨化因子作為 TH1-Treg 細胞極化的誘導劑，以 CXCR3 依賴性方式。在 Arg1⁺TAMs 中特異性檢測到巨噬細胞中 PF4 的高表達，但在其他組織巨噬細胞中未檢測到。此外，我們發現高濃度的乳酸（通常與“Warburg 效應”有關）可能有助于在巨噬細胞中誘導 PF4。常規和巨噬細胞特異性 PF4 缺陷小鼠在 TME 中均表現出腫瘤生長和 TH1-Treg 細胞比率降低。最后，當我們在荷瘤小鼠中使用新生成的 mAb 對 PF4 [抗 PF4 mAb （#6-1-5）] 測試 PF4 中和作用時，TME 中的腫瘤生長和 TH1-Treg 細胞比率均降低，導致抗腫瘤免疫力增強。

結論：

作者發現 Arg1⁺TAM分泌的 PF4 是 TME 中 TH1-Treg 細胞積累的關鍵決定因素，它抑制抗腫瘤免疫并促進腫瘤生長。此外，PF4 中和抑制 TH1-Treg 細胞極化并抑制腫瘤生長。鑒于癌癥基因組圖譜的數據表明，PF4⁺TAM 數量的增加與人類預后較差相關，PF4 代表了癌癥免疫治療的潛在新靶點。

為探究TAMs在TME中TH1-Treg細胞高比例存在中的作用，作者開發了一種基因系統。已知TAMs表達精氨酸酶I（Arg1），其在腫瘤中高度且特異性表達。作者通過使用VeDTR小鼠系統并選擇Cx3cr1和Arg1基因，能夠特異性靶向并清除Arg1+ TAMs。在荷瘤的Cx3cr1-Cre/Arg1-Flp/VeDTR（LF）小鼠中，YFP僅在腫瘤浸潤的CD11b+ Ly6G–細胞中檢測到，且DTR在TAMs中強烈表達。注射DT后，YFP+ CD11b+細胞被耗竭，腫瘤生長顯著受抑，證明了TAM耗竭系統的有效性。

作者發現，Arg1+ TAMs的耗竭對TME中TH1-Treg細胞的狀態有顯著影響。流式細胞術和質譜流式細胞術分析顯示，MC38和B16F10腫瘤中Foxp3+ T-bet+ CD4+ T細胞（TH1-Treg細胞）的比例顯著降低。此外，T-bet+ LAG-3– CD8+ T細胞的比例增加，而其他細胞群的比例相對不變，表明Arg1+ TAM耗竭導致免疫抑制性的TH1-Treg細胞減少，免疫刺激性的CD11b+細胞和T-bet+ LAG-3– CD8+ T細胞增加，從而增強了抗腫瘤免疫。

機制上，TAMs分泌PF4，使Treg細胞極化為TH1-Treg細胞。作者對腫瘤中Arg1+ TAMs和Treg細胞的定位進行檢測，發現它們距離很近，可能存在相互作用。共培養實驗表明，Arg1+ TAMs可使非TH1-Treg細胞極化為TH1-Treg細胞。通過RNA測序分析，作者確定PF4為候選因子。重組PF4蛋白以CXCR3依賴的方式誘導TH1-Treg細胞極化。PF4還增強了TH1-Treg細胞的抑制功能，并且發現其在Arg1+ TAMs中特異性高表達。此外，IFN-γ參與了Treg細胞上CXCR3的初始表達，PF4進一步增強了TH1-Treg細胞極化。TME中PF4的主要來源是Arg1+ TAMs，因為它們比產生CXCL9的cDC1s更為豐富。

作者構建了Pf4?/?小鼠，發現其Arg1+ TAMs和非巨噬細胞類型中的PF4產生被消除。與野生型小鼠相比，Pf4?/?小鼠的腫瘤生長延遲，腫瘤中TH1-Treg細胞比例顯著降低，而脾臟中的比例相當。為評估巨噬細胞來源的PF4的貢獻，作者構建了Cx3cr1-Cre/Pf4fl/fl小鼠。在這些小鼠中，Arg1+ TAMs中的PF4產生存在缺陷，但血小板中的PF4產生正常。腫瘤生長減少，腫瘤中TH1-Treg細胞比例降低，表明巨噬細胞來源的PF4在促進TH1-Treg細胞積累和腫瘤生長中起主要作用。

最后，生成了一種新的PF4單克隆抗體（#6-1-5），可有效中和PF4誘導的TH1-Treg細胞極化。在荷瘤小鼠中施用抗PF4 mAb（#6-1-5）可減少腫瘤生長并降低腫瘤中TH1-Treg細胞比例，而脾臟中的比例不變。這伴隨著IFN-γ+/TNF-α+ CD4+ T細胞和CD8+ T細胞比例的增加，表明抗腫瘤免疫增強。抗PF4 mAb治療不影響Treg細胞向TME的遷移，也對CD8+ T細胞無直接影響。抗腫瘤效應依賴于免疫，因為在RAG2缺陷小鼠中該效應消失。PF4中和也被證明比完全耗竭Treg細胞更安全。與抗CTLA4 mAb的比較表明，抗PF4 mAb即使對TH1-Treg細胞的適度減少也能有效增強抗腫瘤免疫。對TCGA數據的分析顯示，較高的PF4表達水平與癌癥患者較差的預后相關。

總之，研究確定了Arg1+ TAM分泌的PF4是TME中TH1-Treg細胞積累的關鍵決定因素，其抑制抗腫瘤免疫并促進腫瘤生長。基因敲除或抗體介導的PF4中和抑制了TH1-Treg細胞極化并減少了腫瘤生長。這些發現為TME中抗腫瘤免疫調節的分子機制提供了新見解，并提示PF4作為癌癥免疫治療的潛在靶點。未來的研究需要進一步闡明PF4的作用及其與其他因素在不同腫瘤模型和臨床環境中的相互作用。

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原始文獻：

Ayumi Kuratani et al. ,Platelet factor 4–induced TH1-Treg polarization suppresses antitumor immunity. Science 386,eadn8608(2024). DOI:10.1126/science.adn8608