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2024年9月13日，波士頓兒童醫院/哈佛大學的Leonard I. Zon教授團隊，在國際知名期刊Science（IF=56.9）在線發表題為：Transcripts of repetitive DNA elements signal to block phagocytosis of hematopoietic stem cells的論文。 作者使用斑馬魚模型和哺乳動物系統來研究HSPCs內可能阻止巨噬細胞吞噬它們的信號，揭示了調控巨噬細胞與HSPCs相互作用的一種新機制，并為如何影響HSPCs的命運提供了新的理解。

巨噬細胞（Macrophages）是我們免疫系統的一部分，它們在免疫應答、炎癥反應、組織修復以及許多其他生理過程中都起著重要的作用。巨噬細胞通過吞噬細菌、死亡細胞、病毒和其他外來物質來清除它們。造血干細胞（Hematopoietic Stem Cells，HSCs）可以分化為所有類型的血細胞，包括紅血細胞、白血細胞和血小板。在某些情況下，巨噬細胞可以吞噬HSCs。例如，在骨髓移植后，巨噬細胞可能會吞噬移植的HSCs，這可能會導致移植失敗。此外，一些研究也發現，在炎癥或感染的環境中，巨噬細胞可能會吞噬HSCs，可能是作為一種防御機制，以防止感染擴散。

先天免疫細胞，如巨噬細胞和中性粒細胞，通過區分其表面表達的分子來協調清除或吞噬垂死細胞。表面分子，如補體、調理素、暴露的磷脂酰絲氨酸(PS)、鈣網蛋白(Calr)和膜聯蛋白I作為啟動吞噬信號的信號。在特定情況下，這些表面分子在細胞表面高表達。相比之下，表面分子如β -2微球蛋白(B2m)充當“不要吃我”信號。巨噬細胞對異常HSPC有吞噬和修飾兩種作用，但是機制不明。作者通過實時成像和體內細胞條形碼技術證明了“吃我”和“不要吃我”信號之間的平衡分別由活性氧(ROS)和Toll樣受體3 (Tlr3)激活提供。

背景介紹：

造血干細胞 （HSC） 產生所有類型的血細胞，并確保造血系統的終生維持和補充。這些成體干細胞存在于骨髓 （BM） 中的特殊微環境中，但表現出一種獨特的行為，即其一小部分細胞群不斷從 BM 中排出，進入血液循環——這一過程被稱為“干細胞動員”。在臨床上，通過暴露于粒細胞集落刺激因子 （G-CSF） 或 C-X-C 趨化因子受體 4 型 （CXCR4） 拮抗劑，通過藥理學調節造血細胞因子信號傳導來強制 HSC 動員，從而利用這一特性。從外周血中獲取動員的造血干細胞用于隨后的造血干細胞移植，例如，用于治療癌癥、自身免疫性疾病和其他疾病患者。

在胚胎發育過程中，巨噬細胞與血液干細胞相互作用，去除那些表現出高水平細胞應激的細胞。存活的造血干細胞和祖細胞 （HSPC） 可以在成人中增殖并產生血細胞系。Pessoa Rodrigues 等人使用斑馬魚模型和哺乳動物系統來研究 HSPC 中可以防止巨噬細胞吞噬它們的信號。與先天免疫核酸感應相關的分子促進了 HSPCs 表面 β-2-微球蛋白的表達，從而提高了它們與巨噬細胞相互作用時的存活率。損害該途徑減少了成年斑馬魚中不同干細胞克隆的數量。

造血干細胞和祖細胞 （HSPC） 在一生中都會產生成熟的血細胞。在此過程中，HSPC 與骨髓生態位中存在的各種細胞（包括巨噬細胞）相互作用。這些巨噬細胞通過釋放細胞因子和趨化因子并巡邏以去除應激、死亡或衰老的細胞來介導無數過程。以這種方式，巨噬細胞有助于維持組織穩態。在造血過程中，巨噬細胞確保正常造血干細胞的質量，并決定參與成體造血的造血克隆的數量。然后，它們要么完全吞噬干細胞，稱為“厄運”，要么捕獲干細胞細胞物質的一部分，稱為“修飾”。梳理后，干細胞繼續分裂，而注定失敗的 HSPC 克隆被消除。

Calr的表達可由與ROS相關或不相關的過程誘導

作者發現斑馬魚HSPC的ROS水平和表面的Calr呈正相關，表明了ROS水平代表了更高的表面Calr表達。為了系統地評估HSPCs中觸發表面Calr呈遞的途徑，作者篩選了1200個生物活性小分子，發現93種化合物在細胞中以強大的劑量依賴性反應增加表面Calr，54種與ROS增加相關(ROS依賴性)，而39種不影響ROS水平(獨立于ROS)。93種Calr誘導劑中有22種以依賴于Calr3b的方式促進了巨噬細胞-HSPC相互作用。Ros依賴性和Ros非依賴性化合物都以相似的水平增加巨噬細胞-HSPC相互作用比率。這些結果表明，細胞表面Calr水平決定了巨噬細胞-HSPC相互作用。

HSPC ROS水平決定巨噬細胞吞噬或者修飾

接下來作者探討了ROS依賴性和非依賴性化合物如何影響HSPCs與巨噬細胞的相互作用，以及這種相互作用如何決定HSPCs的命運，即被清除（dooming）或被保留（grooming）。研究發現，抗氧化治療阻礙了暴露于ROS依賴性化合物的人類HSPCs表面熱休克蛋白CALR的水平。因此，推測促進清除的化合物可能與由于線粒體功能障礙導致的更高ROS水平有關。相比之下，不依賴于ROS的化合物增加了HSPCs的增殖，這與增加的保留行為一致。這些結果暗示，HSPCs上的表面Calr呈現可以誘導巨噬細胞的交互，但該交互的結果也由HSPCs的細胞ROS水平決定。ROS依賴性化合物刺激了清除行為和HSPCs的死亡，而ROS非依賴性的化合物則刺激了保留行為和HSPCs的增殖。此外還測試了ROS非依賴化合物的體外處理的巨噬細胞的趨化性和吞噬活性。發現ROS獨立的Calr誘導劑并未改變固有的巨噬細胞功能。因此，ROS獨立化合物通過驅動巨噬細胞介導的HSPCs保留行為，而不是誘導巨噬細胞自身效應，來實現其效果。

Tlr3是HSPC修飾所必需的

研究人員選擇了DL-PPMP作為ROS獨立的CALR誘導劑來探討ROS獨立化合物如何誘導HSPCs表面CALR的表達。為了定義需要表達表面CALR的復雜網絡，研究者使用了一種遞送敲除文庫的逆轉錄病毒，該文庫針對18,080個基因。作者將DL-PPMP或DMSO（對照）處理的K562人類白血病細胞進行分選，以獲得CALR-細胞并富集其中的單向導RNA (sgRNA)。作者發現DL-PPMP刺激細胞中富集的基因與胞質DNA/RNA感應和病毒免疫反應有關。在驗證實驗中，TLR3的消耗降低了K562細胞中的表面Calr，表明胞質DNA和/或RNA可能調節表面Calr的增加。

研究進一步探索了DL-PPMP觸發的分子機制，并研究了Tlr3信號如何影響HSPCs的命運。作者分析了先前可獲得的DL-PPMP處理過的人類癌細胞系的大量RNA測序數據。他們發現2285個上調基因與病毒免疫反應相關的途徑有關，例如干擾素-a（IFN-a）的產生、抗原處理以及通過MHC I類處理內源性肽的呈現。在使用DL-PPMP處理的K562細胞中B2m（一種需要用于細胞表面的MHC-I穩定的分子）的表達水平較高。作者評估了Tlr3斑馬魚形態素消耗后中HSPCs表面的B2m水平。他們發現在斑馬魚胚胎中消耗Tlr3導致B2m+ HSPCs的數量減少。研究結果表明，由于Tlr3表達水平較低導致的B2m表達降低，使得HSPCs更加傾向于被巨噬細胞清除。

表面B2m決定Calr介導巨噬細胞-HSPC相互作用的結果

接下來作者用ROS獨立的化合物處理48hpf的斑馬魚胚胎，并使用熒光激活細胞分選（FACS）評估了HSPCs上的表面B2m。他們發現ROS獨立的化合物增加了B2m水平，而"eat-me"或iTlr3處理則降低了表面B2m水平。作者生成了B2m穩定敲除的斑馬魚以確認B2m在巨噬細胞介導的HSPC保留中的角色，觀察到B2m消耗增加了HSPC的清除行為并減少了HSPC的保留行為，進一步支持了表面B2m作為HSPCs上的"不要吞噬我"信號的角色。接下來，他們用ROS獨立的化合物DL-PPMP處理了B2m敲除的胚胎。他們觀察到，DL-PPMP在WT和B2m敲除的胚胎中都刺激了相互作用。然而，B2m敲除的HSPCs被清除，而WT HSPCs則被保留。Tlr3激活級聯可能促進Irf3激活，從而促進b2m的轉錄。

作者進一步使用IFN-stimulated gene 15 (Isg15)作為Tlr3-介導的Irf3反應的報告基因以研究HSPC種群的內在異質性。qPCR分析顯示，Runx1+Isg15+細胞中的內源逆轉錄病毒和B2m表達均有所增加，這表明RE (repetitive elements)轉錄水平較高的HSPC也有更高的B2m水平。重新分析已發布的單細胞RNA-seq數據，發現富含細胞周期基因表達的細胞群的RE表達較高，這表明準備進行增殖的HSPC有更高的RE表達。通過增加整體RE的表達或過表達特定的RE（Ltr4），都能保護HSPC免受巨噬細胞的清除。這些研究結果表明，通過增加內源逆轉錄病毒的水平，可以提供對HSPC清除的保護。作者注意到，內源逆轉錄病毒（ERV）的蛋白質和遺傳物質已經被證明能夠調控內源性免疫反應。在病原體感染時，ERV衍生的增強子和啟動子似乎會被激活，這表明內源性免疫反應和ERV之間可能存在協同激活或訓練免疫反應的功能。所以進一步評估了Tlr3信號在“應急粒細胞生成”中的角色。他們發現，poly I:C刺激后，中性粒細胞的數量增加，這表明可能誘發了應急粒細胞生成。他們還發現，急性髓系白血病（AML）的惡性HSPCs以及人類AML blast中，B2M和TE的表達較高。這表明AML細胞可能會“劫持”“不要吃我”信號來避免被巨噬細胞清除。總的來說，這些數據表明，RE-Tlr3的病毒模擬信號調控HSPCs上的B2m表達，以促進巨噬細胞介導的清除行為，并保護HSPCs免受巨噬細胞的消亡，塑造了HSC的命運決定和克隆增殖。

總之，作者的研究結果支持一個模型，在該模型中，內源性 TLR3 配體導致 b2m 的表達，從而阻斷巨噬細胞誘導的厄運，并通過用巨噬細胞監測干細胞質量來確定造血干細胞克隆性。Calr （“吃我”）和 B2m（“不吃我”） 的平衡控制著通過巨噬細胞介導的質量保證為成人血液系統做出貢獻的長壽命 HSC 克隆的數量。這揭示了 HSPC 克隆擴增和免疫調節細胞清除之間錯綜復雜的相互作用。作者提出，這種保護機制也可能在成年期響應環境壓力而發揮作用，例如在感染期間或克隆干細胞疾病中。通過利用巨噬細胞選擇性去除突變干細胞克隆，操縱“don't eat-me”和“eat-me”信號的水平可能對免疫療法具有重要的治療意義。

相關研究一：巨噬細胞對造血干細胞HSC的質量控制

2022年9月22日，Science發表題為Quality assurance of hematopoietic stem cells by macrophages determines stem cell clonality研究論文，巨噬細胞是造血干細胞HSC質量的控制者。詳情參考鏈接：巨噬細胞對造血干細胞HSC的質量控制。 在2022年9月22日發表的論文中，作者使用了我們荷蘭Liposoma的巨噬細胞清除劑Clodronate Liposomes（貨號CP-005-005）氯膦酸二鈉脂質體巨噬細胞清除套裝。在2024年8月9日的這篇研究中，作者使用了巨噬細胞示蹤熒光脂質體Dil Liposomes。

相關研究二：巨噬細胞通過胞啃作用介導膜物質轉移到造血干細胞HSC

原始文獻：

Cecilia Pessoa Rodrigues et al.Transcripts of repetitive DNA elements signal to block phagocytosis of hematopoietic stem cells.Science385,eadn1629(2024).DOI:10.1126/science.adn1629. https://www.science.org/doi/10.1126/science.adn1629