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2024年9月13日，波士頓兒童醫(yī)院/哈佛大學(xué)的Leonard I. Zon教授團隊，在國際知名期刊Science（IF=56.9）在線發(fā)表題為：Transcripts of repetitive DNA elements signal to block phagocytosis of hematopoietic stem cells的論文。 作者使用斑馬魚模型和哺乳動物系統(tǒng)來研究HSPCs內(nèi)可能阻止巨噬細胞吞噬它們的信號，揭示了調(diào)控巨噬細胞與HSPCs相互作用的一種新機制，并為如何影響HSPCs的命運提供了新的理解。

巨噬細胞（Macrophages）是我們免疫系統(tǒng)的一部分，它們在免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)以及許多其他生理過程中都起著重要的作用。巨噬細胞通過吞噬細菌、死亡細胞、病毒和其他外來物質(zhì)來清除它們。造血干細胞（Hematopoietic Stem Cells，HSCs）可以分化為所有類型的血細胞，包括紅血細胞、白血細胞和血小板。在某些情況下，巨噬細胞可以吞噬HSCs。例如，在骨髓移植后，巨噬細胞可能會吞噬移植的HSCs，這可能會導(dǎo)致移植失敗。此外，一些研究也發(fā)現(xiàn)，在炎癥或感染的環(huán)境中，巨噬細胞可能會吞噬HSCs，可能是作為一種防御機制，以防止感染擴散。

先天免疫細胞，如巨噬細胞和中性粒細胞，通過區(qū)分其表面表達的分子來協(xié)調(diào)清除或吞噬垂死細胞。表面分子，如補體、調(diào)理素、暴露的磷脂酰絲氨酸(PS)、鈣網(wǎng)蛋白(Calr)和膜聯(lián)蛋白I作為啟動吞噬信號的信號。在特定情況下，這些表面分子在細胞表面高表達。相比之下，表面分子如β -2微球蛋白(B2m)充當“不要吃我”信號。巨噬細胞對異常HSPC有吞噬和修飾兩種作用，但是機制不明。作者通過實時成像和體內(nèi)細胞條形碼技術(shù)證明了“吃我”和“不要吃我”信號之間的平衡分別由活性氧(ROS)和Toll樣受體3 (Tlr3)激活提供。

背景介紹：

造血干細胞 （HSC） 產(chǎn)生所有類型的血細胞，并確保造血系統(tǒng)的終生維持和補充。這些成體干細胞存在于骨髓 （BM） 中的特殊微環(huán)境中，但表現(xiàn)出一種獨特的行為，即其一小部分細胞群不斷從 BM 中排出，進入血液循環(huán)——這一過程被稱為“干細胞動員”。在臨床上，通過暴露于粒細胞集落刺激因子 （G-CSF） 或 C-X-C 趨化因子受體 4 型 （CXCR4） 拮抗劑，通過藥理學(xué)調(diào)節(jié)造血細胞因子信號傳導(dǎo)來強制 HSC 動員，從而利用這一特性。從外周血中獲取動員的造血干細胞用于隨后的造血干細胞移植，例如，用于治療癌癥、自身免疫性疾病和其他疾病患者。

在胚胎發(fā)育過程中，巨噬細胞與血液干細胞相互作用，去除那些表現(xiàn)出高水平細胞應(yīng)激的細胞。存活的造血干細胞和祖細胞 （HSPC） 可以在成人中增殖并產(chǎn)生血細胞系。Pessoa Rodrigues 等人使用斑馬魚模型和哺乳動物系統(tǒng)來研究 HSPC 中可以防止巨噬細胞吞噬它們的信號。與先天免疫核酸感應(yīng)相關(guān)的分子促進了 HSPCs 表面 β-2-微球蛋白的表達，從而提高了它們與巨噬細胞相互作用時的存活率。損害該途徑減少了成年斑馬魚中不同干細胞克隆的數(shù)量。

造血干細胞和祖細胞 （HSPC） 在一生中都會產(chǎn)生成熟的血細胞。在此過程中，HSPC 與骨髓生態(tài)位中存在的各種細胞（包括巨噬細胞）相互作用。這些巨噬細胞通過釋放細胞因子和趨化因子并巡邏以去除應(yīng)激、死亡或衰老的細胞來介導(dǎo)無數(shù)過程。以這種方式，巨噬細胞有助于維持組織穩(wěn)態(tài)。在造血過程中，巨噬細胞確保正常造血干細胞的質(zhì)量，并決定參與成體造血的造血克隆的數(shù)量。然后，它們要么完全吞噬干細胞，稱為“厄運”，要么捕獲干細胞細胞物質(zhì)的一部分，稱為“修飾”。梳理后，干細胞繼續(xù)分裂，而注定失敗的 HSPC 克隆被消除。

Calr的表達可由與ROS相關(guān)或不相關(guān)的過程誘導(dǎo)

作者發(fā)現(xiàn)斑馬魚HSPC的ROS水平和表面的Calr呈正相關(guān)，表明了ROS水平代表了更高的表面Calr表達。為了系統(tǒng)地評估HSPCs中觸發(fā)表面Calr呈遞的途徑，作者篩選了1200個生物活性小分子，發(fā)現(xiàn)93種化合物在細胞中以強大的劑量依賴性反應(yīng)增加表面Calr，54種與ROS增加相關(guān)(ROS依賴性)，而39種不影響ROS水平(獨立于ROS)。93種Calr誘導(dǎo)劑中有22種以依賴于Calr3b的方式促進了巨噬細胞-HSPC相互作用。Ros依賴性和Ros非依賴性化合物都以相似的水平增加巨噬細胞-HSPC相互作用比率。這些結(jié)果表明，細胞表面Calr水平?jīng)Q定了巨噬細胞-HSPC相互作用。

HSPC ROS水平?jīng)Q定巨噬細胞吞噬或者修飾

接下來作者探討了ROS依賴性和非依賴性化合物如何影響HSPCs與巨噬細胞的相互作用，以及這種相互作用如何決定HSPCs的命運，即被清除（dooming）或被保留（grooming）。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化治療阻礙了暴露于ROS依賴性化合物的人類HSPCs表面熱休克蛋白CALR的水平。因此，推測促進清除的化合物可能與由于線粒體功能障礙導(dǎo)致的更高ROS水平有關(guān)。相比之下，不依賴于ROS的化合物增加了HSPCs的增殖，這與增加的保留行為一致。這些結(jié)果暗示，HSPCs上的表面Calr呈現(xiàn)可以誘導(dǎo)巨噬細胞的交互，但該交互的結(jié)果也由HSPCs的細胞ROS水平?jīng)Q定。ROS依賴性化合物刺激了清除行為和HSPCs的死亡，而ROS非依賴性的化合物則刺激了保留行為和HSPCs的增殖。此外還測試了ROS非依賴化合物的體外處理的巨噬細胞的趨化性和吞噬活性。發(fā)現(xiàn)ROS獨立的Calr誘導(dǎo)劑并未改變固有的巨噬細胞功能。因此，ROS獨立化合物通過驅(qū)動巨噬細胞介導(dǎo)的HSPCs保留行為，而不是誘導(dǎo)巨噬細胞自身效應(yīng)，來實現(xiàn)其效果。

Tlr3是HSPC修飾所必需的

研究人員選擇了DL-PPMP作為ROS獨立的CALR誘導(dǎo)劑來探討ROS獨立化合物如何誘導(dǎo)HSPCs表面CALR的表達。為了定義需要表達表面CALR的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，研究者使用了一種遞送敲除文庫的逆轉(zhuǎn)錄病毒，該文庫針對18,080個基因。作者將DL-PPMP或DMSO（對照）處理的K562人類白血病細胞進行分選，以獲得CALR-細胞并富集其中的單向?qū)NA (sgRNA)。作者發(fā)現(xiàn)DL-PPMP刺激細胞中富集的基因與胞質(zhì)DNA/RNA感應(yīng)和病毒免疫反應(yīng)有關(guān)。在驗證實驗中，TLR3的消耗降低了K562細胞中的表面Calr，表明胞質(zhì)DNA和/或RNA可能調(diào)節(jié)表面Calr的增加。

研究進一步探索了DL-PPMP觸發(fā)的分子機制，并研究了Tlr3信號如何影響HSPCs的命運。作者分析了先前可獲得的DL-PPMP處理過的人類癌細胞系的大量RNA測序數(shù)據(jù)。他們發(fā)現(xiàn)2285個上調(diào)基因與病毒免疫反應(yīng)相關(guān)的途徑有關(guān)，例如干擾素-a（IFN-a）的產(chǎn)生、抗原處理以及通過MHC I類處理內(nèi)源性肽的呈現(xiàn)。在使用DL-PPMP處理的K562細胞中B2m（一種需要用于細胞表面的MHC-I穩(wěn)定的分子）的表達水平較高。作者評估了Tlr3斑馬魚形態(tài)素消耗后中HSPCs表面的B2m水平。他們發(fā)現(xiàn)在斑馬魚胚胎中消耗Tlr3導(dǎo)致B2m+ HSPCs的數(shù)量減少。研究結(jié)果表明，由于Tlr3表達水平較低導(dǎo)致的B2m表達降低，使得HSPCs更加傾向于被巨噬細胞清除。

表面B2m決定Calr介導(dǎo)巨噬細胞-HSPC相互作用的結(jié)果

接下來作者用ROS獨立的化合物處理48hpf的斑馬魚胚胎，并使用熒光激活細胞分選（FACS）評估了HSPCs上的表面B2m。他們發(fā)現(xiàn)ROS獨立的化合物增加了B2m水平，而"eat-me"或iTlr3處理則降低了表面B2m水平。作者生成了B2m穩(wěn)定敲除的斑馬魚以確認B2m在巨噬細胞介導(dǎo)的HSPC保留中的角色，觀察到B2m消耗增加了HSPC的清除行為并減少了HSPC的保留行為，進一步支持了表面B2m作為HSPCs上的"不要吞噬我"信號的角色。接下來，他們用ROS獨立的化合物DL-PPMP處理了B2m敲除的胚胎。他們觀察到，DL-PPMP在WT和B2m敲除的胚胎中都刺激了相互作用。然而，B2m敲除的HSPCs被清除，而WT HSPCs則被保留。Tlr3激活級聯(lián)可能促進Irf3激活，從而促進b2m的轉(zhuǎn)錄。

作者進一步使用IFN-stimulated gene 15 (Isg15)作為Tlr3-介導(dǎo)的Irf3反應(yīng)的報告基因以研究HSPC種群的內(nèi)在異質(zhì)性。qPCR分析顯示，Runx1+Isg15+細胞中的內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒和B2m表達均有所增加，這表明RE (repetitive elements)轉(zhuǎn)錄水平較高的HSPC也有更高的B2m水平。重新分析已發(fā)布的單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)富含細胞周期基因表達的細胞群的RE表達較高，這表明準備進行增殖的HSPC有更高的RE表達。通過增加整體RE的表達或過表達特定的RE（Ltr4），都能保護HSPC免受巨噬細胞的清除。這些研究結(jié)果表明，通過增加內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒的水平，可以提供對HSPC清除的保護。作者注意到，內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒（ERV）的蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)已經(jīng)被證明能夠調(diào)控內(nèi)源性免疫反應(yīng)。在病原體感染時，ERV衍生的增強子和啟動子似乎會被激活，這表明內(nèi)源性免疫反應(yīng)和ERV之間可能存在協(xié)同激活或訓(xùn)練免疫反應(yīng)的功能。所以進一步評估了Tlr3信號在“應(yīng)急粒細胞生成”中的角色。他們發(fā)現(xiàn)，poly I:C刺激后，中性粒細胞的數(shù)量增加，這表明可能誘發(fā)了應(yīng)急粒細胞生成。他們還發(fā)現(xiàn)，急性髓系白血病（AML）的惡性HSPCs以及人類AML blast中，B2M和TE的表達較高。這表明AML細胞可能會“劫持”“不要吃我”信號來避免被巨噬細胞清除。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，RE-Tlr3的病毒模擬信號調(diào)控HSPCs上的B2m表達，以促進巨噬細胞介導(dǎo)的清除行為，并保護HSPCs免受巨噬細胞的消亡，塑造了HSC的命運決定和克隆增殖。

總之，作者的研究結(jié)果支持一個模型，在該模型中，內(nèi)源性 TLR3 配體導(dǎo)致 b2m 的表達，從而阻斷巨噬細胞誘導(dǎo)的厄運，并通過用巨噬細胞監(jiān)測干細胞質(zhì)量來確定造血干細胞克隆性。Calr （“吃我”）和 B2m（“不吃我”） 的平衡控制著通過巨噬細胞介導(dǎo)的質(zhì)量保證為成人血液系統(tǒng)做出貢獻的長壽命 HSC 克隆的數(shù)量。這揭示了 HSPC 克隆擴增和免疫調(diào)節(jié)細胞清除之間錯綜復(fù)雜的相互作用。作者提出，這種保護機制也可能在成年期響應(yīng)環(huán)境壓力而發(fā)揮作用，例如在感染期間或克隆干細胞疾病中。通過利用巨噬細胞選擇性去除突變干細胞克隆，操縱“don't eat-me”和“eat-me”信號的水平可能對免疫療法具有重要的治療意義。

相關(guān)研究一：巨噬細胞對造血干細胞HSC的質(zhì)量控制

2022年9月22日，Science發(fā)表題為Quality assurance of hematopoietic stem cells by macrophages determines stem cell clonality研究論文，巨噬細胞是造血干細胞HSC質(zhì)量的控制者。詳情參考鏈接：巨噬細胞對造血干細胞HSC的質(zhì)量控制。 在2022年9月22日發(fā)表的論文中，作者使用了我們荷蘭Liposoma的巨噬細胞清除劑Clodronate Liposomes（貨號CP-005-005）氯膦酸二鈉脂質(zhì)體巨噬細胞清除套裝。在2024年8月9日的這篇研究中，作者使用了巨噬細胞示蹤熒光脂質(zhì)體Dil Liposomes。

相關(guān)研究二：巨噬細胞通過胞啃作用介導(dǎo)膜物質(zhì)轉(zhuǎn)移到造血干細胞HSC

原始文獻：

Cecilia Pessoa Rodrigues et al.Transcripts of repetitive DNA elements signal to block phagocytosis of hematopoietic stem cells.Science385,eadn1629(2024).DOI:10.1126/science.adn1629. https://www.science.org/doi/10.1126/science.adn1629