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概要

進行體內巨噬細胞特異性耗竭的能力仍然是在廣泛的生理背景下揭示巨噬細胞功能的有效手段。與小鼠模型相比，斑馬魚具有卓越的成像能力，因為它們從單細胞階段到整個幼蟲發育過程中都具有光學透明度。這些品質對于體內細胞特異性耗竭變得很重要，因此可以通過顯微鏡實時跟蹤和驗證目標細胞的消除。有多種方法可以去除斑馬魚中的巨噬細胞，包括遺傳（例如 irf8 敲除）、化學遺傳（例如硝基還原酶/甲硝唑系統）和基于毒素的耗竭（例如使用氯膦酸鹽脂質體）。在吞噬脂質體后使用含氯膦酸鹽的脂質體誘導巨噬細胞凋亡可有效消耗巨噬細胞以及測試其吞噬能力。在這里，我們描述了通過靜脈注射補充有熒光葡聚糖偶聯物的氯膦酸脂質體來全身耗竭斑馬魚幼蟲巨噬細胞的詳細方案。與熒光葡聚糖共注射可以實時跟蹤巨噬細胞耗竭，從驗證成功靜脈注射到巨噬細胞分子攝取及其最終死亡開始。為了驗證巨噬細胞的高度耗竭，當在早期幼蟲階段進行氯膦酸鹽注射時，可以通過快速中性紅色活體染料染色來確定腦巨噬細胞（小膠質細胞）消除的水平。

Experimental workflow for in vivo macrophage-specific depletion by liposomal clodronate in larval zebrafish

背景

巨噬細胞是先天免疫系統的關鍵成分，在應對感染、無菌炎癥和環境變化方面發揮著重要作用。將巨噬細胞的功能與不同生理環境中相互作用的細胞類型的復雜組合解耦的最有效方法之一是能夠特異性地消除巨噬細胞并分析表型后果。小鼠的這種耗竭實驗為巨噬細胞的作用提供了很多見解（Hua et al., 2018; Rosowski, 2020）。然而，我們對巨噬細胞功能的理解仍然不完整，小鼠模型中的細胞耗竭實驗難以實時跟蹤和驗證。由于這些原因，斑馬魚幼蟲的光學透明度和易于操作性通過對靶細胞和整個完整生物體進行實時成像，為體內高度可追溯和可處理的細胞消融提供了明顯的優勢。斑馬魚的基因和免疫系統也與人類的基因和免疫系統具有高度的正統性（Yoder et al., 2002; Santoriello et al., 2012; Howe et al., 2013）。此外，斑馬魚的適應性免疫系統直到幼年成年階段才在功能上成熟（Lam et al., 2004），這使得斑馬魚幼蟲成為研究獨立于適應性免疫貢獻的先天免疫系統的絕佳平臺。

斑馬魚目前可用的巨噬細胞耗竭方法包括遺傳和化學遺傳操作，以及基于毒素的耗竭。巨噬細胞的發育需要轉錄因子Pu.1（基因名稱為spi1b）以及另一種轉錄因子Irf8的早期和持續功能（Li et al., 2011; Shiau et al., 2015; Tenor et al., 2015）。通過基因敲除或嗎啉諾（MO）反義低聚物敲低PU.1或irf8的破壞，為巨噬細胞耗竭提供了一種可靠的方法，而前者消融骨髓細胞，后者對巨噬細胞更具特異性，但也會導致中性粒細胞數量的增加（Shiau et al., 2015; Yang et al., 2020）。這些方法不適合時間控制（Rhodes et al., 2005; Li et al., 2011; Shiau et al., 2015; Rosowski, 2020），而氯膦酸鹽介導的基于局部顯微注射的巨噬細胞耗竭可以實現一定程度的空間和時間指定（Bernut et al., 2014）。

氯膦酸鹽（也稱為二氯亞甲基二膦酸鹽）可以被細胞代謝以阻斷線粒體呼吸，這是由于形成不可水解的ATP類似物，然后導致細胞死亡（細胞凋亡）（Rosowski, 2020）。一旦注射包封在脂質體中，氯膦酸鹽很容易被巨噬細胞攝入和消除，因為它在細胞內積聚（van Rooijen and Hendrikx, 2010）。由于所使用的氯膦酸鹽和脂質體磷脂對其他非吞噬細胞都沒有毒性（van Rooijen and Hendrikx, 2010），這種方法允許特異性消耗已經存在的吞噬巨噬細胞。

作為我們方案設計的一部分，我們將熒光標記的葡聚糖與氯膦酸脂質體共同注射，以使我們能夠驗證精確和準確的注射，并跟蹤氯膦酸對整個幼蟲中巨噬細胞的影響。為此，在氯膦酸脂質體與熒光標記的葡聚糖靜脈內共注射后，我們目視驗證了這些物質成功注射到循環中，并監測了巨噬細胞對熒光葡聚糖的攝取及其隨時間推移的最終死亡。我們設計了該方案，包括注射后48小時，以允許氯膦酸誘導巨噬細胞凋亡的作用實現，因為先前在雞和小鼠中的工作表明氯膦酸的功效可能需要幾天時間，具體取決于組織（Kameka et al., 2014; Ponzoni et al., 2018）。我們通過評估腦駐留巨噬細胞（小膠質細胞）的剩余數量，證實了氯膦酸鹽介導的巨噬細胞耗竭在注射后48小時內的療效，因為可以通過中性紅色活體染料染色對活幼蟲中的小膠質細胞進行快速分析。我們選擇在幼蟲早期階段注射3 dpf（受精后幾天），因為這是在血腦屏障成熟之前（Jeong et al., 2008; O’Brown et al., 2019），當時我們發現我們注射的物質很容易到達包括大腦在內的全身巨噬細胞。使用氯膦酸鹽生效的 48 小時窗口，我們能夠在大多數注射的斑馬魚幼蟲中實現小膠質細胞的完全消融（Yang et al., 2020）。總體而言，我們發現以3dpf的48小時孵育時間靜脈顯微注射氯膦酸脂質體可有效消除巨噬細胞。

參考文獻

1. Bernut, A., Herrmann, J. L., Kissa, K., Dubremetz, J. F., Gaillard, J. L., Lutfalla, G. and Kremer, L. (2014). Mycobacterium abscessus cording prevents phagocytosis and promotes abscess formation. Proc Natl Acad Sci U S A 111(10): E943-952.

2. Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F., Torrance, J., Berthelot, C., Muffato, M., Collins, J. E., Humphray, S., McLaren, K. and Matthews, L. et al. (2013). The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature 496(7446): 498-503.

3. Hua, L., Shi, J., Shultz, L. D. and Ren, G. (2018). Genetic models of macrophage depletion. Methods Mol Biol 1784: 243-258.

4. Jeong, J. Y., Kwon, H. B., Ahn, J. C., Kang, D., Kwon, S. H., Park, J. A. and Kim, K. W. (2008). Functional and developmental analysis of the blood-brain barrier in zebrafish. Brain Res Bull 75(5): 619-628.

5. Kameka, A. M., Haddadi, S., Jamaldeen, F. J., Moinul, P., He, X. T., Nawazdeen, F. H., Bonfield, S., Sharif, S., van Rooijen, N. and Abdul-Careem, M. F. (2014). Clodronate treatment significantly depletes macrophages in chickens. Can J Vet Res 78(4): 274-282.

6. Karlsson, J., von Hofsten, J. and Olsson, P. E. (2001). Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Mar Biotechnol (NY) 3(6): 522-527.

7. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J. and Sin, Y. M. (2004). Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol 28(1): 9-28.

8. Li, L., Jin, H., Xu, J., Shi, Y. and Wen, Z. (2011). Irf8 regulates macrophage versus neutrophil fate during zebrafish primitive myelopoiesis. Blood 117(4): 1359-1369.

9. O'Brown, N. M., Megason, S. G. and Gu, C. (2019). Suppression of transcytosis regulates zebrafish blood-brain barrier function. Elife 8: e47326.

10. Ponzoni, M., Pastorino, F., Di Paolo, D., Perri, P. and Brignole, C. (2018). Targeting macrophages as a potential therapeutic intervention: impact on inflammatory diseases and cancer. Int J Mol Sci 19(7).

11. Rhodes, J., Hagen, A., Hsu, K., Deng, M., Liu, T. X., Look, A. T. and Kanki, J. P. (2005). Interplay of pu.1 and gata1 determines myelo-erythroid progenitor cell fate in zebrafish. Dev Cell 8(1): 97-108.

12. Rosowski, E. E. (2020). Determining macrophage versus neutrophil contributions to innate immunity using larval zebrafish. Dis Model Mech 13(1): dmm041889.

13. Santoriello, C. and Zon, L. I. (2012). Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest 122(7): 2337-2343.

14. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P. and Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods 9(7): 676-682.

15. Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M. and Talbot, W. S. (2015). Differential requirement for irf8 in formation of embryonic and adult macrophages in zebrafish. PLoS One 10(1): e0117513.

16. Tenor, J. L., Oehlers, S. H., Yang, J. L., Tobin, D. M. and Perfect, J. R. (2015). Live imaging of host-parasite interactions in a zebrafish infection model reveals cryptococcal determinants of virulence and central nervous system invasion. mBio 6(5): e01425-01415.

17. van Rooijen, N. and Hendrikx, E. (2010). Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol Biol 605: 189-203.

18. Yang, L., Jimenez, J. A., Earley, A. M., Hamlin, V., Kwon, V., Dixon, C. T. and Shiau, C. E. (2020). Drainage of inflammatory macromolecules from the brain to periphery targets the liver for macrophage infiltration. Elife 9: e58191.

19. Yoder, J. A., Nielsen, M. E., Amemiya, C. T. and Litman, G. W. (2002). Zebrafish as an immunological model system. Microbes Infect 4(14): 1469-1478.

原始文獻

1. Yang, L., Rojas, A. M. and Shiau, C. E. (2021). Liposomal Clodronate-mediated Macrophage Depletion in the Zebrafish Model. Bio-protocol 11(6): e3951. DOI: 10.21769/BioProtoc.3951.

2. Yang, L., Jimenez, J. A., Earley, A. M., Hamlin, V., Kwon, V., Dixon, C. T. and Shiau, C. E. (2020). Drainage of inflammatory macromolecules from the brain to periphery targets the liver for macrophage infiltration. Elife 9: e58191.