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巨噬細胞無論是在維持機體的生理穩(wěn)態(tài)還是斡旋組織的病理炎性，都發(fā)揮重要的作用。此外，巨噬細胞也促進多種疾病的病理生理學(xué)，如包括癌癥和各種炎癥性紊亂。巨噬細胞功能的多樣性也正如它起源的復(fù)雜性（當(dāng)然爭議性更大），形態(tài)的異質(zhì)性，表型的可塑性。因此，巨噬細胞作為一種具有可塑性，多能性和異質(zhì)性的細胞群體,在體內(nèi)和體外不同的微環(huán)境影響下,表現(xiàn)出獨特的表型和功能，體現(xiàn)的是一個在時間和空間上受一系列機體免疫學(xué)網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控的復(fù)雜動態(tài)連續(xù)性生物學(xué)過程。

為了更好的研究巨噬細胞功能，設(shè)計研究實驗時，要在時間上（疾病的發(fā)生和發(fā)展）和空間上（病灶的原位，組織，器官）考慮到巨噬細胞的起源，更新，補充，形態(tài)，表型和功能的連續(xù)性，動態(tài)性和網(wǎng)絡(luò)性。

Q1.為什么Clodronate Liposomes（氯膦酸二鈉脂質(zhì)體）是研究巨噬細胞功能的利器？

A1：巨噬細胞在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。它們主要通過可溶性分子，如細胞因子和趨化因子的介導(dǎo)來調(diào)節(jié)許多非吞噬細胞的功能。巨噬細胞還通過攝取和消化微生物或非自身顆粒和大分子參與身體的“穩(wěn)態(tài)”。內(nèi)吞物的消化是由其溶酶體酶介導(dǎo)的。

脂質(zhì)體是人工制備的脂質(zhì)囊泡，由夾帶水性隔室的同心磷脂雙層組成。它們可用于包封溶解在水溶液中的強親水性分子，例如氯膦酸鹽，一種為人類應(yīng)用開發(fā)的無毒二膦酸鹽。

注射后，氯膦酸鹽脂質(zhì)體起到特洛伊木馬的作用。巨噬細胞攝取氯膦酸鹽脂質(zhì)體并消化脂質(zhì)體膜。氯膦酸鹽不會被消化，并會留在巨噬細胞內(nèi)。更多氯膦酸鹽將在巨噬細胞中積聚，因為它會攝取和消化更多的氯膦酸鹽脂質(zhì)體。當(dāng)氯膦酸鹽在細胞內(nèi)聚集到一定的濃度后，氯膦酸鹽會通過啟動其程序性細胞死亡即細胞凋亡來清除巨噬細胞[1]。

通過選擇氯膦酸鹽脂質(zhì)體的正確給藥途徑，給藥時間點，給藥頻率和給藥部位，可以清除特定器官或組織中的巨噬細胞。因此，氯膦酸鹽脂質(zhì)體是研究巨噬細胞功能的極好工具[2]。

Q2.Clodronate Liposomes（氯膦酸二鈉脂質(zhì)體）和Clodronate（氯膦酸二鈉）的半衰期是多少？

A2：死亡巨噬細胞釋放的氯膦酸鹽的半衰期（t1 / 2）為數(shù)分鐘[3]，因為游離氯膦酸鹽通過腎臟系統(tǒng)迅速從循環(huán)中被清除。 由于難以通過細胞膜，游離氯膦酸鹽分子不易進入細胞，包括脂質(zhì)體磷脂雙分子層。 然而，如果它們留在周圍的介質(zhì)中，它們可能會慢慢積聚到細胞中[4]。

氯膦酸鹽脂質(zhì)體的半衰期很難確定。 脂質(zhì)體難以從血液中分離，并且它們在動物中的分布不均勻。 此外，氯膦酸鹽脂質(zhì)體的半衰期取決于巨噬細胞攝取和消化所需的時間，這由許多因素決定，例如：動物疾病模型的免疫全能性，給藥途徑，給藥劑量。

Q3.實驗清除巨噬細胞不成功，可能的原因有哪些？

A3：氯膦酸鹽脂質(zhì)體活性的失敗可能是由于各種原因：

1）有效期已過：超過有效期后無法確保活性;

2）在極端溫度下儲存：氯膦酸鹽脂質(zhì)體應(yīng)儲存在4到8攝氏度之間。冷凍脂質(zhì)體或溫度高于30攝氏度會影響膜的穩(wěn)定性并降低氯膦酸鹽脂質(zhì)體活性;

3）脂質(zhì)體懸浮液的稀釋：這會影響懸浮液中的滲透壓，這可能導(dǎo)致脂質(zhì)體膜的不穩(wěn)定;

4）給藥方案不合理：給藥方案應(yīng)仔細選擇并考慮多種因素，例如：

a.打算消耗的巨噬細胞的類型（例如庫普弗細胞，小膠質(zhì)細胞，肺泡巨噬細胞，破骨細胞）。例如，可以通過氣管內(nèi)給藥靶向肺泡巨噬細胞，而內(nèi)皮/上皮屏障另一側(cè)的間質(zhì)巨噬細胞不會被該給藥途徑靶向;

b.是否打算短期或長期消耗它們;

c.動物的體重：較大的動物需要更多的氯膦酸鹽脂質(zhì)體才能達到清除閾值。

5）脂質(zhì)體懸浮液在使用前未重新懸浮：脂質(zhì)體在儲存期間傾向于沉淀，確保在使用前輕輕搖動重懸，以防止僅注射不含脂質(zhì)體的PBS溶液;

6）注射時出錯：確保注射是否成功非常重要。例如，如果您在尾靜脈注射期間看到鼓包形成，則可能是您注射到皮膚組織了，沒有注射到靜脈里。當(dāng)腹膜內(nèi)注射時，確保將脂質(zhì)體懸浮液注射到腹腔內(nèi)（而不是在腸內(nèi)）。為了驗證脂質(zhì)體是否已到達您想要的位置，可以使用熒光Dil脂質(zhì)體;

7）檢驗清除的手段是否正確：需要選擇正確的標(biāo)記來確定清除是否成功。此外，您需要考慮到每種給藥方案和（動物）模型的巨噬細胞的消耗和再增殖動力學(xué)不同。

Q4.實驗動物在注射后立即死亡，可能的原因有哪些？

A4：這很可能是由于注射了非均質(zhì)的沉淀脂質(zhì)體。 沉淀的脂質(zhì)體可引起栓塞，從而部分或完全阻斷動脈或靜脈中的血流。 由于脂質(zhì)體在儲存期間容易沉淀，因此請確保在使用前顛倒混勻。

另一個原因可能是脂質(zhì)體懸浮液的溫度。 脂質(zhì)體應(yīng)儲存在4到8攝氏度之間，但應(yīng)平衡到室溫后給藥。

注意：如果注射需要較長，脂質(zhì)體可能在注射器中沉淀，當(dāng)使用相同的注射器注射多只動物時，這可能導(dǎo)致差異劑量。

Q5.實驗動物在注射后數(shù)小時或者數(shù)天死亡，可能的原因是什么？

A5：這很可能是由注射前或注射過程中的微生物污染引起的。當(dāng)注射氯膦酸鹽脂質(zhì)體時，巨噬細胞的清除可使動物更容易受到感染，尤其是免疫缺陷動物。

Q6.如何存儲脂質(zhì)體懸液？

A6：儲存在4-8oC（或39-47oF）之間。 脂質(zhì)體懸浮液不應(yīng)該冷凍，也不應(yīng)暴露在極端高溫下。

Q7.氯膦酸二鈉脂質(zhì)體懸液的濃度是多少？

A7：平均而言，整個脂質(zhì)體懸浮液的濃度為5mg氯膦酸鹽/ mL。 氯膦酸鹽以CH2Na2Cl2O6P2·5H2O的形式包封在脂質(zhì)體囊泡中。

Q8.脂質(zhì)體的粒徑和電荷是多少？

A8：所有的脂質(zhì)體（即氯膦酸鹽，PBS和熒光Dil脂質(zhì)體）都帶有輕微帶負電，因此不會聚集在一起。 懸浮液中的脂質(zhì)體沒有按特定的粒徑截留，脂質(zhì)體的大小不等（最大3微米）。 平均而言，脂質(zhì)體的大小為1.7微米。

Q9.溶解脂質(zhì)體的緩沖液是什么？

A9：所有的脂質(zhì)體制劑（即氯膦酸鹽脂質(zhì)體，對照脂質(zhì)體和熒光Dil脂質(zhì)體）懸浮于無菌磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）：10mM Na2HPO4,10mM NaH2PO4，>140mM NaCl中。

Q10.如何檢測熒光Dil脂質(zhì)體？

A10：用熒光染料DiI標(biāo)記的脂質(zhì)體，作為對照，可用于研究脂質(zhì)體是否已通過所選的給藥方案達到靶向的巨噬細胞群。 熒光標(biāo)記將顯示脂質(zhì)體在組織內(nèi)的分布模式及其對巨噬細胞的攝取。 Dil標(biāo)記的脂質(zhì)體可以通過流式細胞術(shù)和熒光顯微鏡檢測。 DiI分子的激發(fā)和發(fā)射分別為549和565nm。

Q11.發(fā)表研究成果時，如何引用LIPOSOMA的產(chǎn)品？

A11：當(dāng)用LIPOSOMA的脂質(zhì)體制劑用于實驗并打算發(fā)表研究成果時，引用格式：“LIPOSOMA，the Netherlands（clodronateliposomes.com）”。

參考文獻：

1. Van Rooijen, N., & Hendrikx, E. (2010). Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. In Liposomes (pp. 189-203). Humana Press.

2. Van Rooijen, N., Sanders, A., & van den Berg, T. K. (1996). Apoptosis of macrophages induced by liposome-mediated intracellular delivery of clodronate and propamidine. Journal of immunological methods, 193(1), 93-99.

3. Fleisch, H. (2000). Bisphosphonates in bone disease: from the laboratory to the patient. Elsevier.

4.Claassen, I., Van Rooijen, N., & Claassen, E. (1990). A new method for removal of mononuclear phagocytes from heterogeneous cell populations in vitro, using the liposome-mediated macrophage ‘suicide’ technique. Journal of immunological methods, 134(2), 153-161.