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巨噬細胞無論是在維持機體的生理穩態還是斡旋組織的病理炎性，都發揮重要的作用。此外，巨噬細胞也促進多種疾病的病理生理學，如包括癌癥和各種炎癥性紊亂。巨噬細胞功能的多樣性也正如它起源的復雜性（當然爭議性更大），形態的異質性，表型的可塑性。因此，巨噬細胞作為一種具有可塑性，多能性和異質性的細胞群體,在體內和體外不同的微環境影響下,表現出獨特的表型和功能，體現的是一個在時間和空間上受一系列機體免疫學網絡所調控的復雜動態連續性生物學過程。

為了更好的研究巨噬細胞功能，設計研究實驗時，要在時間上（疾病的發生和發展）和空間上（病灶的原位，組織，器官）考慮到巨噬細胞的起源，更新，補充，形態，表型和功能的連續性，動態性和網絡性。

Q1.為什么Clodronate Liposomes（氯膦酸二鈉脂質體）是研究巨噬細胞功能的利器？

A1：巨噬細胞在免疫系統中發揮重要作用。它們主要通過可溶性分子，如細胞因子和趨化因子的介導來調節許多非吞噬細胞的功能。巨噬細胞還通過攝取和消化微生物或非自身顆粒和大分子參與身體的“穩態”。內吞物的消化是由其溶酶體酶介導的。

脂質體是人工制備的脂質囊泡，由夾帶水性隔室的同心磷脂雙層組成。它們可用于包封溶解在水溶液中的強親水性分子，例如氯膦酸鹽，一種為人類應用開發的無毒二膦酸鹽。

注射后，氯膦酸鹽脂質體起到特洛伊木馬的作用。巨噬細胞攝取氯膦酸鹽脂質體并消化脂質體膜。氯膦酸鹽不會被消化，并會留在巨噬細胞內。更多氯膦酸鹽將在巨噬細胞中積聚，因為它會攝取和消化更多的氯膦酸鹽脂質體。當氯膦酸鹽在細胞內聚集到一定的濃度后，氯膦酸鹽會通過啟動其程序性細胞死亡即細胞凋亡來清除巨噬細胞[1]。

通過選擇氯膦酸鹽脂質體的正確給藥途徑，給藥時間點，給藥頻率和給藥部位，可以清除特定器官或組織中的巨噬細胞。因此，氯膦酸鹽脂質體是研究巨噬細胞功能的極好工具[2]。

Q2.Clodronate Liposomes（氯膦酸二鈉脂質體）和Clodronate（氯膦酸二鈉）的半衰期是多少？

A2：死亡巨噬細胞釋放的氯膦酸鹽的半衰期（t1 / 2）為數分鐘[3]，因為游離氯膦酸鹽通過腎臟系統迅速從循環中被清除。 由于難以通過細胞膜，游離氯膦酸鹽分子不易進入細胞，包括脂質體磷脂雙分子層。 然而，如果它們留在周圍的介質中，它們可能會慢慢積聚到細胞中[4]。

氯膦酸鹽脂質體的半衰期很難確定。 脂質體難以從血液中分離，并且它們在動物中的分布不均勻。 此外，氯膦酸鹽脂質體的半衰期取決于巨噬細胞攝取和消化所需的時間，這由許多因素決定，例如：動物疾病模型的免疫全能性，給藥途徑，給藥劑量。

Q3.實驗清除巨噬細胞不成功，可能的原因有哪些？

A3：氯膦酸鹽脂質體活性的失敗可能是由于各種原因：

1）有效期已過：超過有效期后無法確保活性;

2）在極端溫度下儲存：氯膦酸鹽脂質體應儲存在4到8攝氏度之間。冷凍脂質體或溫度高于30攝氏度會影響膜的穩定性并降低氯膦酸鹽脂質體活性;

3）脂質體懸浮液的稀釋：這會影響懸浮液中的滲透壓，這可能導致脂質體膜的不穩定;

4）給藥方案不合理：給藥方案應仔細選擇并考慮多種因素，例如：

a.打算消耗的巨噬細胞的類型（例如庫普弗細胞，小膠質細胞，肺泡巨噬細胞，破骨細胞）。例如，可以通過氣管內給藥靶向肺泡巨噬細胞，而內皮/上皮屏障另一側的間質巨噬細胞不會被該給藥途徑靶向;

b.是否打算短期或長期消耗它們;

c.動物的體重：較大的動物需要更多的氯膦酸鹽脂質體才能達到清除閾值。

5）脂質體懸浮液在使用前未重新懸浮：脂質體在儲存期間傾向于沉淀，確保在使用前輕輕搖動重懸，以防止僅注射不含脂質體的PBS溶液;

6）注射時出錯：確保注射是否成功非常重要。例如，如果您在尾靜脈注射期間看到鼓包形成，則可能是您注射到皮膚組織了，沒有注射到靜脈里。當腹膜內注射時，確保將脂質體懸浮液注射到腹腔內（而不是在腸內）。為了驗證脂質體是否已到達您想要的位置，可以使用熒光Dil脂質體;

7）檢驗清除的手段是否正確：需要選擇正確的標記來確定清除是否成功。此外，您需要考慮到每種給藥方案和（動物）模型的巨噬細胞的消耗和再增殖動力學不同。

Q4.實驗動物在注射后立即死亡，可能的原因有哪些？

A4：這很可能是由于注射了非均質的沉淀脂質體。 沉淀的脂質體可引起栓塞，從而部分或完全阻斷動脈或靜脈中的血流。 由于脂質體在儲存期間容易沉淀，因此請確保在使用前顛倒混勻。

另一個原因可能是脂質體懸浮液的溫度。 脂質體應儲存在4到8攝氏度之間，但應平衡到室溫后給藥。

注意：如果注射需要較長，脂質體可能在注射器中沉淀，當使用相同的注射器注射多只動物時，這可能導致差異劑量。

Q5.實驗動物在注射后數小時或者數天死亡，可能的原因是什么？

A5：這很可能是由注射前或注射過程中的微生物污染引起的。當注射氯膦酸鹽脂質體時，巨噬細胞的清除可使動物更容易受到感染，尤其是免疫缺陷動物。

Q6.如何存儲脂質體懸液？

A6：儲存在4-8oC（或39-47oF）之間。 脂質體懸浮液不應該冷凍，也不應暴露在極端高溫下。

Q7.氯膦酸二鈉脂質體懸液的濃度是多少？

A7：平均而言，整個脂質體懸浮液的濃度為5mg氯膦酸鹽/ mL。 氯膦酸鹽以CH2Na2Cl2O6P2·5H2O的形式包封在脂質體囊泡中。

Q8.脂質體的粒徑和電荷是多少？

A8：所有的脂質體（即氯膦酸鹽，PBS和熒光Dil脂質體）都帶有輕微帶負電，因此不會聚集在一起。 懸浮液中的脂質體沒有按特定的粒徑截留，脂質體的大小不等（最大3微米）。 平均而言，脂質體的大小為1.7微米。

Q9.溶解脂質體的緩沖液是什么？

A9：所有的脂質體制劑（即氯膦酸鹽脂質體，對照脂質體和熒光Dil脂質體）懸浮于無菌磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）：10mM Na2HPO4,10mM NaH2PO4，>140mM NaCl中。

Q10.如何檢測熒光Dil脂質體？

A10：用熒光染料DiI標記的脂質體，作為對照，可用于研究脂質體是否已通過所選的給藥方案達到靶向的巨噬細胞群。 熒光標記將顯示脂質體在組織內的分布模式及其對巨噬細胞的攝取。 Dil標記的脂質體可以通過流式細胞術和熒光顯微鏡檢測。 DiI分子的激發和發射分別為549和565nm。

Q11.發表研究成果時，如何引用LIPOSOMA的產品？

A11：當用LIPOSOMA的脂質體制劑用于實驗并打算發表研究成果時，引用格式：“LIPOSOMA，the Netherlands（clodronateliposomes.com）”。

參考文獻：

1. Van Rooijen, N., & Hendrikx, E. (2010). Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. In Liposomes (pp. 189-203). Humana Press.

2. Van Rooijen, N., Sanders, A., & van den Berg, T. K. (1996). Apoptosis of macrophages induced by liposome-mediated intracellular delivery of clodronate and propamidine. Journal of immunological methods, 193(1), 93-99.

3. Fleisch, H. (2000). Bisphosphonates in bone disease: from the laboratory to the patient. Elsevier.

4.Claassen, I., Van Rooijen, N., & Claassen, E. (1990). A new method for removal of mononuclear phagocytes from heterogeneous cell populations in vitro, using the liposome-mediated macrophage ‘suicide’ technique. Journal of immunological methods, 134(2), 153-161.